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家兔颈动脉内膜切除前后局部动脉壁血管内皮生长因子及其基因表达

发表时间:2008-05-15 发表者:神经外科 (访问人次:1103)

徐永革,周定标,余新光,王嘉玲

 

 预防颈动脉内膜切除术(carotid   endarterectomy,CEA)后再狭窄临床面临严峻挑战。再狭窄的主要病理改变是肌内膜增殖。近年来,有人用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白孵化或基因转染的方法使球囊损伤的大鼠颈动脉内皮修复加速,内膜增殖减轻〔1,2〕。但到目前为止,尚无VEGF基因或蛋白在CEA手术中应用的临床或实验报告,也无CEA手术前后动脉壁局部VEGF蛋白或基因表达变化特点的研究报告,本研究是CEA局部VEGF蛋白孵化或基因转染防治再狭窄研究的前提。

1材料与方法

1.1 实验动物及分组  健康新西兰白兔30只,雌雄不拘,体重3.6~4.9公斤。随机分为A、B、C、D、E和F六组。其中A(5只)、B(5只)、C(4只)、D(5只)和E组(4只)动物为实验组,按本课题组建立的方法(文章另发表),在双侧颈动脉气体干燥损伤后高脂喂养两个月,制成粥样硬化性狭窄模型。A组(CEA术前组)模型制成后立即直接进行灌注固定颈动脉取材;B~E组分别于双侧CEA后即刻、CEA后3日、CEA后7日和CEA后21日灌注固定颈动脉取材(CEA术后即开始普通饲料喂养)。F组为正常血管对照组,以普通饲料喂养两个月后灌注固定颈动脉取材。

1.2 主要试剂  VEGF(C-1)单克隆抗体;ABC免疫组化试剂盒;原位杂交检测试剂盒,包括PK(蛋白酶K)(1:10),Hyb A液,Hyb B液(即地高辛标记的探针),马血清(1:100)(-20℃保存),抗Dig-AP(1:500),NBT(1:100),BCIP(1:100)(4℃保存),均为北京大学医学部病理系提供。

1.3 实验方法

1.3.1家兔CEA:动物肌肉注射复合氯氨酮(40~50mg/Kg)麻醉。仰卧固定于手术床上。颈部脱毛后应用无菌技术进行如下操作:颈部正中切口,暴露颈总动脉。于手术显微镜下游离10~12mm。于对侧颈静脉注入肝素钙盐水(100U/Kg体重)。以低压力联杆动脉夹孤立颈总动脉7~8mm。于动脉前壁正前方以尖刀沿血管纵轴方向做一切口,长约5mm。以肝素钙盐水冲洗血管腔。剪除切口两侧约0.3mm以内之血管外膜。于显露之血管腔内间隔约5mm以5号注射针头尖端做相互平行之两条环周之动脉内膜切口,切除两切口之间的内膜及内侧薄层中膜。充分冲洗后以10-0单丝尼龙线缝合动脉切口。针距约0.3mm,边距约0.2mm。在缝合最后一针闭合血管之前,近端之动脉夹开闭一次,使有小量血液自切口涌出,以将血管腔内之气体和内膜碎屑冲出。缝合最后一针后打结4枚。动脉切口处贴一小块明胶海绵,棉签轻压,撤出联杆动脉夹,重建血流。同法行对侧CEA。缝合皮下组织及皮肤,手术完毕。

 动脉粥样硬化颈动脉之CEA手术方法与上述正常CEA相似,只是因内膜增厚并发生了粥样硬化改变,病变层更容易自中膜分离。此术中非常值得注意的就是显露分离颈动脉时要仔细小心不要造成血管的额外损伤,同时要处理好漂浮瓣。

1.3.2组织取材与病理处理:动物按计划喂养相应时间后中性福尔马林生理压灌注固定,切取双侧颈动脉并浸泡于福尔马林液中再固定。将颈动脉平铺,常规脱水,石蜡包埋,与血管纵轴平行切片,行CD34,VEGF免疫组化染色和VEGF mRNA原位杂交检查。用PBS替代抗VEGF抗体(一抗)作为阴性对照。

2 结果

2.1 CASS家兔CEA手术后的内皮再生  CEA手术前,病变血管之管腔面覆盖之单层内皮基本完整。CEA手术后3日,即使近切缘之中膜创面亦未见内皮覆盖,局部仅见少量炎细胞浸润。CEA手术后7日,见明显内皮增殖,覆盖近切缘处创面。CEA手术后21日,切缘处内皮增殖严重,近切缘处中膜创面有较完整的单层内皮覆盖。

2.2 颈动脉粥样硬化性狭窄(carotid  atherosclerotic stenosis,CASS)家兔CEA手术前后局部动脉壁之VEGF蛋白表达

2.2.1术前VEGF免疫组化检查:正常血管的内膜和中膜内均未见棕染区域。粥样硬化血管的内皮细胞无明显棕染;粥样斑块内VEGF蛋白表达明显增加,呈片状或点状分布于细胞外基质中,偶有泡沫细胞棕染。

2.2.2术后不同时间VEGF免疫组化检查:术后即刻:在粥样硬化血管内膜切缘和裸露的中膜创面均未见明显棕染区域;近切缘处的未切的斑块内仍见片状棕色浓染区。术后3日:在粥样硬化血管内膜切缘附近见较多的炎细胞浸润,周围有较淡的棕染区域。术后7日:在粥样硬化血管内膜切缘处见内皮细胞增殖,数量增多,部分中膜创缘已被内皮覆盖。增殖的内皮细胞内和新生内皮下的中膜内均可见棕黄染色。术后21日:距离内皮切缘一定范围内再生的内皮细胞已经覆盖裸露的中膜创面。新生的内皮细胞偶有棕染,但其下中膜内未见明显棕染区。PBS替代VEGF抗体试验阴性,说明VEGF免疫组化具有特异性。

2.3 CASS家兔CEA手术前后局部动脉壁之VEGF mRNA基因表达

2.3.1术前VEGF mRNA原位杂交检测:CEA手术之前,正常血管VEGF mRNA原位杂交检测均未见VEGF基因表达。而粥样硬化血管的粥样斑块中可见VEGF mRNA表达,表达定位于泡沫细胞。

2.3.2术后不同时间VEGF mRNA原位杂交检测:术后即刻至术后3日:无论内膜切缘还是中膜创面皆未见VEGF基因表达。术后7日:内膜切缘处内皮细胞增殖明显,细胞内可见VEGF基因高表达――呈较深的紫色反应,但内膜切除区的受创中膜内未见紫染区。术后21日:新生内皮和被新生内皮覆盖的中膜内无明显VEGF mRNA表达。粥样硬化血管无探针对照原位杂交检测阴性,肯定了杂交阳性结果的意义。

3 讨论

3.1 动脉损伤后新内膜增殖与内皮再生的关系 各种内皮损伤模型动物实验结果均强调内皮在控制内膜生长中的关键作用〔3,4〕。如果仅仅是内皮衬里丧失较大面积,中膜没有或仅有轻微损伤,可以在14天内形成较厚的新内膜。如果剥脱的范围较大,则先内皮化的区域内膜增厚较轻〔5〕,而已经完成内皮化的区域内平滑肌细胞的增殖率比未内皮化区域内低。该现象的机制包括内皮细胞免渗透屏障(non-permeable  barrier)作用的恢复(该屏障可保护平滑肌细胞免受循环血中或血小板释放的生长促进因子的作用)以及生长抑制分子(硫酸乙酰肝素,EDRF-NO)的释放。本组CEA手术后3日,即使近切缘之中膜创面亦未见内皮覆盖,局部仅见少量炎细胞浸润。CEA手术后7日,见明显内皮增殖,覆盖近切缘处创面。CEA手术后21日,切缘处内皮增殖严重,近切缘处中膜创面有较完整的单层内皮覆盖。

3.2外源性VEGF在血管修复中的作用  1995年,Asahara等〔2〕报告VEGF对新鲜损伤内膜的内皮化和抑制内膜增厚的作用。用球囊损伤SD大鼠左颈动脉内膜,将100ug的VEGF与内膜孵育30 min,对照组仅孵育生理盐水,2周后VEGF组的内皮化速度明显超过对照组,球囊损伤后4周,VEGF治疗组的内皮化速度仍超过对照组,而且VEGF治疗组的内膜增厚也明显减轻。因此,作者认为,应用VEGF这一特异性地作用于内皮细胞的生长调节分子,可以在体内有效地促进内皮再生,因而间接地减轻平滑肌细胞增殖引起的新内膜增厚。新近,有人报告在家兔血管成形术后即时进行VEGF基因转染以抑制内膜增殖〔5〕。该实验中,对新西兰白兔进行球囊损伤的同时以phVEGF165(编码165个氨基酸的VEGF基因)进行基因转染。早在转染后36小时就可观察到基因表达,并持续2周,直至第3周消失。转染后5天可观察到血清VEGF浓度明显增加。VEGF转染的动脉在第7天时再内皮化已几乎完成,而对照组第7天时再内皮化的范围还不到50%,即使到第4周时仍有20%的区域未完成再内皮化。经VEGF基因处理的动脉新内膜增厚较轻,而随后的血管造影也证实其管腔直径也比对照组大。同时,经phVEGF165处理的动物发生血栓性闭塞的频率也较对照组低。

  上述研究表明,血管内皮生长因子具有潜在加速体内内皮再生、改善内皮功能,从而干预内膜生长的能力。

3.3 VEGF在粥样硬化血管CEA手术后局部动脉壁的表达特点及其意义CEA术后即刻~3日,CEA术后即刻,粥样硬化血管内膜切缘和裸露的中膜创面均未见VEGF表达;近切缘处的未切的斑块内仍见VEGF高表达。CEA术后3日,粥样硬化血管内膜切缘附近见较多的炎细胞浸润,周围见VEGF低表达。术后即刻至术后3日,无论内膜切缘还是中膜创面皆未见VEGF基因表达。该组结果提示在CEA后3天内,手术损伤性刺激和血流中各种因子的作用尚未使平滑肌VEGF合成明显增加。CEA术后7日,粥样硬化血管内膜切缘处见内皮细胞增殖,数量增多,部分中膜创缘已被内皮覆盖;增殖的内皮细胞内和新生内皮下的中膜内可见VEGF中度表达;斑块内仍有VEGF高表达。原位杂交检测显示,内膜切缘处内皮细胞增殖明显,细胞内可见VEGF基因高表达――呈较深的紫色反应,但新生内内皮覆盖区中膜内未见紫染区。该结果提示,至术后1周左右,在各种因素的作用下,平滑肌细胞受到刺激合成和分泌VEGF明显增加;内皮增殖区VEGF表达增加,内皮细胞VEGF mRNA表达明显上调,说明除平滑肌旁分泌的VEGF作用到内皮细胞以外,增殖的内皮细胞本身也能合成VEGF并可能是CEA后一定时期内内源性VEGF的主要来源。已有细胞培养实验证实,碱性成纤维细胞生长因子,转型生长因子-β和血小板源生长因子等生长因子的刺激可增加VEGF表达〔6,7〕;而缺氧可增加内皮细胞和血管平滑肌细胞等许多细胞系的VEGF mRNA表达〔6,8〕CEA术后21日,距离内皮切缘一定范围内再生的内皮细胞已经覆盖裸露的中膜创面。新生的内皮层可见VEGF低表达,但其下中膜内无明显VEGF表达。正常血管CEA后21日,中膜内亦无VEGF表达,仅单层内皮呈淡棕黄染色。说明无论在正常的还是粥样硬化改变的血管,随着内皮再生中膜创面被覆盖,中膜中VEGF的表达逐渐降低,到3周时已有较大范围的被新生内皮覆盖的中膜内VEGF的表达已不明显。此期的原位杂交检测显示,新生内皮和被新生内皮覆盖的中膜内VEGF mRNA的表达已经不明显,说明该段血管CEA后的内皮修复已基本完成。

 本实验表明,CEA后,局部中膜平滑肌和增殖的内皮细胞均能合成VEGF,并在术后1周左右达到高峰。因此,若CEA术中引入外源性VEGF基因或蛋白,可能加速再内皮化,防止或减轻CEA后再狭窄。

http://sjnjzx.cn/html/academic_thesis/VEGF_CEA.html 

参考文献

http://sjnjzx.cn/html/academic_thesis/VEGF_CEA.html 

1.Burke PA, Pehmann-Bruinsma K, and Powell JS. Vascular endothelial growth factor causes endothelial proliferation after vascular injury. Biochem Biophys Res Commun 1995,207:348-354

2.Asahara T, Bauters C, and Pastore C, et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation 1995,91:2793-2801

3.Fishman JA, Ryan GB, and Karnovsky MJ. Endothelial regeneration in the rat carotid artery and the significance of endothelial denudation in the pathogenesis of myointimal thickening. Lab Invest 1975,32:339-351

4.Reidy MA. Endothelial regeneration Ⅶ. Interaction of smooth muscle cells with endothelial regrowth. Lab Invest 1991,59:36-43

5.Asahara T, Chen D, and Tsurumi Y, et al. Accelerated restitution of endothelial integrity and endothelium-dependent function after phVEGF165 gene transfer. Circulation 1996,94:3291-3302

6.Stavri GT, Zachary IC, and Baskerville PA, et al. Basic fibroblast growth factor upregulate the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Circulation 1995,92:11-14

7.Brogi E, Wu T, Namiki A, and Isner JM. Indirect angiogenic smooth muscle cells. Circulation 1994,90:649-652

8.Hamdan AD, Aiello LP, and Misare BD, et al. Vascular endothelial growth factor expression in canine peripheral vein by pass grafts. J Vasc Surg 1997, 26:79-86

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解放军总医院第二附属医院神经外科现拥有主任医师、博士、硕士等多层次人才梯队,具有深厚的专业理论基础知识,熟悉本专业前沿科技发展动态,在工作中不断创新,积极开展新业务、新技术,填补了多项院内空白,有些项...
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