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颈动脉粥样硬化性狭窄动物模型的建立

发表时间:2008-05-15 发表者:神经外科 (访问人次:1709)

徐永革,周定标,郑集义,姚林

既往有关颈动脉内膜切除手术(carotid endarterectomy,CEA)的实验研究,都是在健康动物的正常颈动脉上进行,与临床实际情况相距甚远〔1~5〕。特别是在探讨手术后动脉壁愈合的分子生物学机制时,选用健康动物正常血管作为实验对象,实验结果的临床参考价值就要大打折扣。因此,建立一个稳定可行的适于临床外科治疗研究的颈动脉粥样硬化性狭窄(carotid atherosclerotic stenosis,CASS)的动物模型甚为必要。

 

材料与方法

1主要实验材料

       胆固醇;花生油;鼠抗人α-SMA,Ki-67和CD68等单克隆抗体(购自北京中山生物技术公司);精密玻璃转子气体流量计(LZB-2型)(沈阳正兴流量仪表有限公司生产)。

2 实验方法

2.1 高脂饲料加工:按2%胆固醇、6%花生油和92%普通颗粒饲料的比例加工配制。

2.2 动物分组及饲养:健康新西兰白兔共25只,雌雄不拘,体重3.6~5.1kg,由军医进修学院实验动物中心提供并饲养。高脂喂养组动物分为A、B、C和D四组,保证每组至少5只动物实验成功。对照组2只,普通饲料饲养两个月后评价血管。

2.3 实验程序:普通饲料适应性喂养1周→取耳血查血脂→高脂喂养1周→行双侧颈总动脉气体干燥损伤→高脂喂养2周~3个月不等(A组:2周;B组:1个月;C组:2个月;D组:3个月)→取耳血查血脂→颈动脉DSA检查→原位生理压灌注固定→切取双侧颈动脉并浸泡于福尔马林液中再固定→以颈动脉病变部为中心进行组织取材和多种病理学检查,包括HE染色,Masson染色,Verhoef-Van Gieson染色以及α-SMA,Ki-67和CD68等免疫组化染色。

2.4 颈动脉内膜气体干燥损伤法:肌肉注射复方氯氨酮(40~50mg/kg)麻醉动物,仰卧固定。以无菌技术显露并游离一侧颈总动脉,长约12mm。以动脉夹孤立颈总动脉长约8mm。于近端阻断夹的远侧2mm处刺入26-G静脉输液针,在远端阻断夹近侧约1mm处穿出管腔,而后针头缩回管腔内。由穿刺针向被隔离的颈动脉段内注入生理盐水2ml。再接医用氮气,以120ml/min的流量风吹血管腔15min。而后以生理盐水置换出管腔内气体,恢复血流,压迫止血。术后每日肌注青霉素20万单位,共3天。

2.5 血管造影片颈动脉狭窄程度的判定方法:以photoshop6.0软件精确测量造影片每根颈动脉最狭窄区的最小残腔直径(DMS)和狭窄远端正常颈总动脉直径(DCC)。狭窄率="(DCC-DMS)/" DCC×100%。狭窄程度的判定:狭窄率<30%为轻度狭窄,30%~69%为中度狭窄,70%~99%为重度狭窄,100%为闭塞。

2.6 统计处理:在微机上用SPSS8.0软件包完成数据的统计处理。数据用均数±标准差表示。多个均数的比较用单因素方差分析(One Way ANOV),均数的多重两两比较用LSD检验。

 

结果

1只家兔于损伤实验中因失血过多死亡;2只家兔于喂养中颈部切口感染死亡。其余22只家兔均按计划完成实验。

1 颈动脉的狭窄程度

所有40根实验血管管腔均有不同程度狭窄(参见图1),无完全闭塞者。各组平均狭窄率分别是:A组为46.32%±19.29%;B组为72.80%±19.28%;C组为73.47%±22.26%;D组为59.19%±25.22%。其中A组与B组以及A组与C组狭窄率差异有极显著意义(P<0.01)。而B组与C组之间,B组与D组之间以及C组与D组之间狭窄率差异无统计学意义(P>0.05)。各组中度以上狭窄均达到80%。                                  2 颈动脉粥样硬化性狭窄血管局部的病理形态学特点                                                                                                   2.1 典型粥样硬化血管横断切片观察:①常规HE染色:血管管腔明显狭窄;内膜不均匀异常增厚,其内有数目较多的泡沫细胞,细胞外有大量不染色的脂质沉积。②Masson染色:管壁的中膜(红染)明显变薄。③Verhoeff-Van Gieson染色:血管内膜中有大量的弹力纤维(淡黑染色)和胶原纤维(淡红染色)分布。④免疫组织化学染色:α-SMA染色示血管内膜内有数量较多的部分胞浆棕染的平滑肌源性泡沫细胞;中膜平滑肌层明显变薄。增殖标记物Ki-67染色示增厚的内膜内有大量胞核棕染的增殖细胞(肌内膜细胞)。CD68染色示增厚的内膜内有大量胞浆棕染的巨噬细胞。参见图2。

2.2 高脂喂养不同时间的粥样硬化病变之病理特点:①A组:内膜轻度增殖;内膜下少许泡沫细胞和脂质沉积,内弹力层基本存在;中膜厚度无明显改变;血管结构基本完整。②B组:肌内膜增殖较重,内膜中见大量增殖的平滑肌细胞,泡沫细胞较少;中膜变薄。③C组:内膜进一步增厚,细胞数目减少,但细胞体积增大,胞内脂质成分增多;细胞外基质明显增多;中膜进一步变薄;内中膜之间常见裂隙。④D组:管壁病变更为严重,细胞核数目进一步减少,病变内充满大量无定形脂质或坏死细胞成分,偶见胆固醇结晶。参见图3。

3 高脂喂养不同时间家兔血脂测定结果

各时间段血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的检查结果见表1。

 

讨论

1 快速复制动脉粥样硬化动物模型的基本条件

内皮损伤和脂质浸润是粥样硬化病变产生的最根本机制〔6〕。所以在考虑复制粥样硬化动物模型时,一定要考虑这两个基本条件:内皮损伤和高脂喂养。本实验采用内皮气体干燥损伤加高脂喂养的方法达到了预想的目的。因此,人为血管损伤,尤其是内皮损伤,附加高脂喂养是尽快复制动脉硬化性狭窄模型所不可缺少的条件。

2 高脂饲料配方

在高脂饲料配方选择上,Kritchevsk等〔7〕的研究认为花生油比玉米油、奶酪和可可油更容易诱发纤维斑块较厚的粥样硬化病变。本文确定含2%胆固醇和6%花生油的饲料为喂养动物之高脂饲料。在内膜损伤的基础上,以该配方喂养动物两个月,已达到明显的纤维斑块期。虽然喂养三个月时,血管平均狭窄率较2个月时有所降低(分别是59.19%±25.22%和73.47%±22.26%),但这一差异无统计学意义(P>0.05),而且病理改变更为严重。粥样硬化病变无随时间消退迹象。

3 本文动脉内膜气体干燥损伤法的优点

LeVeen等〔8〕在1982年首次报告隔离的动脉段气体干燥损伤附加高脂饲料喂养复制粥样硬化病变。由于干燥的气流直接风吹血管内膜,所以损伤最严重的是内膜,中膜损伤相对轻微。而不象用球囊剥脱法复制动脉狭窄模型造成了动脉壁的全层损伤。由于隔离血管段的长度可以准确掌握,干燥气体的流速可以精确控制,因而损伤程度可保持相对恒定。如果高脂喂养条件保持稳定,则制成的模型也相对稳定。本文的实验结果证实了这一点。到1998年,几位作者〔8~14〕借用此方法复制的粥样硬化动物模型均用于有关防治球囊血管成形术后再狭窄研究。所选血管均是兔的股动脉。与LeVeen等人〔8〕的研究比较,本文在以下方面有所改进或突破:①首次成功地将CASS模型复制于动物的颈动脉,使得相关实验研究与临床情形更为接近,并可以之研究病变与脑缺血的关系。②首次应用经股动脉插管颈动脉血管造影评价血管狭窄程度,而不是Le Veen等应用的损伤较大的穿刺心脏注射造影剂造影的方法,提高了接受该项检查动物存活率。③确立了新的实验参数。通过预实验,发现按Le Veen等人应用的损伤参数(气体流量50ml/min,风吹时间4~8min)不能在国产新西兰家兔颈动脉制成狭窄模型。经过多个参数尝试之后,我们确定了本实验的损伤参数为:气体流量120ml/min,风吹时间15min。这是成功地在新西兰白兔颈动脉制成理想病变的重要因素。目前尚不能很好解释本文损伤参数与Le Veen报告的参数差异较大的原因。Le Veen等选用的是Flemish巨兔,平均体重5.05±0.45kg。动物品种和体重(本组家兔平均体重为4.6±0.74kg)差异可能是原因之一。

4 血脂水平与高脂喂养时间的关系

4.1 TC和LDL-C:易于造成内皮损伤并易于进入内膜下参与粥样硬化形成的TC成分是LDL-C。高脂喂养15日,LDL-C较基础值增长了29倍;喂养30日无明显变化;至喂养60日时该指标有所降低(P<0.01),但仍比其基础水平高出15倍;至喂养90日时,此项指标又有所降低(P<0.05),但仍比各自基础值高出12倍,仍能充分发挥其极强的促粥样硬化作用。随着喂养时间的延长,LDL-C值降低的原因可能动物的适应性和耐受性有关。

4.2 HDL-C:HDL-C是具有抗粥样硬化作用的TC成分。高脂喂养15日,HDL-C仅升高了3倍;喂养30日,HDL-C值继续攀升(P<0.01),增加到基础值的15倍;在后来的两个月中该值无明显变化(P>0.05),其比基础值增加的倍数与LDL-C相似。

4.3 甘油三酯(TG):高脂喂养15日后,TG水平是基础值的4倍,至喂养90日TG水平无明显变化(皆P>0.05)。TG主要反映膳食因素,该测定结果说明在3个月的喂养期内,动物对脂质的摄取相对稳定。

5 血管狭窄程度与高脂喂养时间的关系

统计学分析表明,一月组、二月组和三月组三组间平均狭窄率差异无统计学意义(皆P>0.05)。一月组、二月组和三月组中度以上狭窄超过80%,重度狭窄率都达到或接近50%。因此仅从狭窄程度考虑,一月组、二月组和三月组的狭窄程度皆符合外科实验研究需要(狭窄50% ~90%)。

6 动脉粥样硬化病理改变与高脂喂养时间的关系

实验结果表明,随着高脂喂养时间的延长,粥样硬化改变在逐渐加重。高脂喂养半月、1个月、2个月和3个月时分别达到粥样硬化改变的脂纹期、早期纤维斑块期、较成熟的纤维斑块期和早期粥样斑块期。因此喂养2个月时血管的病理改变已能满足实验研究需要。

7 该动物模型的评价

本实验建立的气体干燥损伤后高脂喂养2个月制成的动脉粥样硬化模型到达了以下要求:①狭窄血管局部的病理改变达到成熟的纤维斑块期,与人类典型的粥样硬化病变已很接近;②血管狭窄达到了满意程度:平均狭窄率超过70%,80%以上的血管达到中、重度狭窄,而又无完全闭塞者,与临床接受CEA或经皮腔内颈动脉血管成形支架置入术的病人的动脉狭窄程度相吻合(50%~99%);③粥样硬化性狭窄位于颈总动脉,与临床操作部位相近;④能用临床最常用、最可靠的方法――动脉血管造影来检测和评价狭窄程度、部位和范围;  模型建立的周期较短,仅两个月; 选取家兔作为实验动物,其解剖结构与人接近,动物大小和血管口径具有较好的可操作性,而且动物来源充足,动物购买和饲养费用相对低廉。因此,该方法建立的CASS动物模型,适合在CASS外科治疗的实验研究中推广应用。

 

参考文献

 

1.Bush HL, Jakubiwski JA, Sentissi JM, et al: Neointimal hyperplasia occurring after carotid endarterectomy in a canine model: effect of endothelial cell seeding vs perioperative aspirin. J Vasc Surg 1987,5:118-126

2. Hanson SR, Powell JS, Dodson T, et al: Effects of angiotensin converting enzyme inhibition with cilazapril on intimal hyperplasia in injured arteries and vascular grafts in the baboon. Hypertension 1991,18:Ⅱ70

3.Sasaki T, Kassell N, and Turner DM, et al: Microsurgical carotid endarterectomy in rats. Neurosurg 1984,15:683-689

4.Southern FN, Cruz N, and Fink LM, et al: Hyperhomocysteinemia increases intimal hyperplasia in a rat carotid endarterectomy model. J Vasc Surg 1998,28:909-918

5.Sidawy AN, Sumpiio BE, and DePalma RG. Armonk: Response of the arterial wall to injury and intimal hyperplasia. From ‘The Basic Science of Vascular Disease’. NY: Futura Publishing Company, Inc.1997: 294

6.Meredith IT: Role of impaired endothelium-dependent vasodipation in ischemic manifestations of coronary artery disease. Circulation 1993,87(Suppl Ⅴ):Ⅴ56

7.Kritchevsky D, Tepper SA, and Kim HK, et al: Experimental atherosclerosis in rabbits fed cholesterol-free diets:  5.Cpmparison of peanut, corn, butter, and coconut oils. Exp Mol Pathol 1976,24:375-391

8.Le Veen RF, Wolf GL and Villanueva TG: New rabbit atherosclerosis model for the investigation of transluminal angioplasty. Invest Radiol 1982,17:470-475

9.Sarembock IJ, La Veau PJ, and Sigal SL,et al: Influence of inflation pressure and balloon size on the development of intimal hyperplasia after balloon angioplasty: A study in the atherosclerotic rabbit. Circulation 1989,80:1029-1040

10.La Veau PJ, Sarembock IJ, and Sigal SL, et al: Vascular reactivity after balloon angioplasty in an atherosclerotic rabbit. Circulation 1990,82:1790-1801

11.Sarembock IJ, La Veau PJ and Sigal SL,et al: Effectiveness of recombinant desulphatohirudin(CGP 39393) in reducing restenosis after balloon angioplasty if atherosclerotic femoral arteries in rabbits. Circulation 1991,84:232-243

12.Gertz SD, Gimple LW, and Ragosta M, et al: Response of femoral arteries of cholesterol-fed rabbits to balloon angioplasty with or without laser: Emphasis on the distribution of foam cells. Exp Mol Pathol 1993,59:225-243

13.Gertz SD, Gimple LW, and Banai S, et al: Geometric remodeling is not the principal pathogenetic process in restenosis after balloon angioplasty. Circulation 1994,90:3001-3008

14.Dongay B, Dol-Geizes F, and Herbert J-M: Effect of fanrofarone, a new Ca2+ channel antagonist, on angioplasty-induced vasospasm in an atherosclerotic rabbit model. Biochem pharmacol 1998,55:2047-2050

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